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添加瓊脂改善木薯和糖蜜機械攪拌發(fā)酵制備細菌纖維素的探究論文
細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種具有納米纖維結構的微生物胞外聚合物，具有獨特的理化性質和力學性能，如極強的持水性、高結晶度與高拉伸強度以及生物可降解性。基于以上性能 BC 在許多領域具有應用潛力，如保健食品、功能性紙張、紡織品、功能性材料、以及包括傷科敷料和人工血管在內的生物醫(yī)學材料等。自然界中，能夠生產細菌纖維素的微生物包括醋酸桿菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬、八疊球菌屬等。目前利用椰子水和木葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）在靜態(tài)培養(yǎng)條件下已實現(xiàn)工業(yè)化生產，但是存在以下問題：1）由于近年對 BC 的市場需求越來越大，椰子水資源已顯匱乏；2）靜態(tài)生產的低效和高成本極大地限制了 BC 的大規(guī)模生產與商業(yè)應用。為了尋找新的價廉量大的生產原料以及提高效率和降低生產成本，研究者嘗試開發(fā)許多資源豐富的生物質資源和利用發(fā)酵罐動態(tài)生產。近期報道的生物質資源包括魔芋粉、麥秸、稻稈、廢棄棉織物、廢紙漿和云杉等。
木薯（Cassava）是一種多年生木本灌木，其塊根呈肉質，含有豐富的淀粉，作為經濟類作物，主要用于加工淀粉和家用飼料。隨著國家能源戰(zhàn)略的實施，近年來木薯的應用結構發(fā)生了很大的變化，應用于工業(yè)發(fā)酵中的比例迅速增加，特別是用于燃料乙醇的生產。糖蜜（Molasses）是制糖工業(yè)的副產物，呈黑褐色，組成成分中大部分為可發(fā)酵性糖。常見的糖蜜主要有甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜以及玉米糖蜜等。雖然糖蜜中含糖量較高，但是其干物質濃度大，灰分與膠體物質多，所以在發(fā)酵應用前需要進行預處理，如硫酸預處理能使甜菜糖蜜的發(fā)酵產量得到明顯提高。前期工作中，本團隊曾嘗試利用糖蜜靜態(tài)發(fā)酵制備細菌纖維素并獲成功。
目前生產細菌纖維素的主要方法為靜態(tài)培養(yǎng)，但是該法生產效率低，僅適合膜狀纖維素的小規(guī)模生產。相對而言，常規(guī)的機械攪拌發(fā)酵動態(tài)培養(yǎng)可以控制多個參數，易于優(yōu)化工藝流程，更適合工業(yè)化生產，且易于在發(fā)酵企業(yè)推廣。但是機械攪拌發(fā)酵過程 中菌體對攪拌葉輪剪切力的高度敏感性，易變異退化，為此本團隊曾報道了剪切力對木葡糖醋桿菌及細菌纖維素合成的影響。由此可見發(fā)酵過程中，剪切力與溶氧是影響菌體發(fā)酵效果的重要因素，剪切力小且溶氧率大是細菌纖維素生產菌的較佳發(fā)酵環(huán)境。常規(guī)液體深層機械攪拌發(fā)酵中若要增加溶氧，一般常用的增加轉速會帶來高剪切力，因此在剪切力與溶氧之間需要尋找到一個平衡點。本文分別以糖蜜與木薯為發(fā)酵碳源，考慮通過添加瓊脂來增加發(fā)酵液粘度以減小剪切力，在 3 L 機械攪拌發(fā)酵罐中研究不同濃度瓊脂對細菌纖維素生產的影響。
1 實驗
1.1 菌體與原料
所用菌株 Gluconacetobacter xylinus ATCC 23770 由本實驗室保藏。接種在裝有固體培養(yǎng)基的試管中放于 4℃的冰箱中存放。使用時挑取菌落一環(huán)，置于三角瓶液體培養(yǎng)基中，于 30℃搖床 160 r/min 活化。木薯（華南五號）和糖蜜均購自中國廣西。
1.2 原料預處理
糖蜜預處理（采用酸―熱處理法）：按糖蜜與去離子水 1∶4（w/w）的比例配置成約 1 L 糖蜜水溶液，經 4 mol/LH2SO4調 pH 值至 3，在 120℃溫度下熱處理 20 min，過夜，6 000 r/min 離心 20 min 后得到糖蜜預處理液。
木薯酶解液（采用兩步酶解法）：按去皮切塊的新鮮木薯與去離子水 1∶1.5（w/V）的比例加入高速粉碎機，在 22 000 r/min 速度下勻漿粉碎 5 min，先經高溫α-淀粉酶水解（水解條件為酶用量 123 U/g、pH6.0、87.4℃、53 min）；待酶解液溫度降至室溫后再進行糖化酶水解（水解條件為酶用量 133 U/g、pH4.5、62.2℃、86 min）。酶解完成后用干凈的八層紗布進行過濾，濾液在 6 000 r/min 條件下離心 20 min，收集上清液，即得到木薯酶解液，以 DNS 法測定還原糖含量，并根據濃度進一步配置發(fā)酵培養(yǎng)基。
1.3 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基包括葡萄糖 25 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L、瓊脂 18 g/L。種子培養(yǎng)基除了不含瓊脂外，其它組分同斜面培養(yǎng)基。
糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基包括糖蜜預處理液 40 g/L（以還原糖計）、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L。木薯發(fā)酵培養(yǎng)基包括木薯酶解液 40 g/L（以還原糖計）、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L。
所有培養(yǎng)基的初始 pH 值用 1 mol/L 硫酸和 1 mol/L 氫氧化鈉調至 5.0，并在 121℃下滅菌 20 min。
1.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)
實驗所用的 3 L 機械攪拌式發(fā)酵罐由上海保興生物設備工程有限公司加工制造，該設備配有兩個擋板，有效工作體積 2 L，裝有兩個四葉斜槳（直徑 5 cm，上下共兩個，相距 10 cm），并配有溶氧電極（梅特勒-托利多公司）、pH 電極（梅特勒-托利多公司）和溫度電極，以及原位活細胞濃度在線分析儀（英國 Aberinstruments 公司），分別用于測定溶解氧、pH 值、溫度和活菌濃度。
1.5 細菌纖維素的處理與測定
發(fā)酵液樣品經過離心后，上清液用于測定還原糖含量，而含有絮狀纖維素的沉淀物用 1 mol/L NaOH在 85℃水浴鍋中堿煮 20 min，4 000 r/min 離心 15 min，然后用去離子水洗滌，再次離心，上述步驟重復兩次以去除纖維素中的菌體和殘留的培養(yǎng)基。
2 結果與討論
2.1 以木薯為原料添加瓊脂對細菌纖維素生產的影響
每12 h取樣測得的纖維素產量隨發(fā)酵時間的變化趨勢，圖3為發(fā)酵結束最終放罐的纖維素產量。圖 2 顯示當發(fā)酵液中加入 0.2%的瓊脂時，纖維素合成速度最快，產量最高，在前 24 h 產量緩慢增長，24 h后產量開始迅速增加，72 h后增長放緩，96 h后纖維素產量基本不再增加，至發(fā)酵末纖維素產量達到7.3 g/L。加入 0.4%瓊脂的發(fā)酵液生產細菌纖維素的速度也較快，產量僅次于前者。未加入瓊脂的發(fā)酵液無論合成纖維素的速度還是產量都是最低的，發(fā)酵產量由低到高依次為 0.0%＜0.8%＜0.6%＜0.4%＜0.2%，合成的纖維素產量依次為 6.1、6.5、6.8、6.9 和 7.3 g/L。該結果說明適量的添加瓊脂可以提高纖維素的合成產量，但是隨著瓊脂量的增多，發(fā)酵液粘度可能過大會影響菌體的生長，不利于纖維素的合成。由于發(fā)酵過程中絮狀纖維素會貼附在發(fā)酵罐內壁以及葉片上導致纖維素產量的數據失真，所以在發(fā)酵結束后測定整體發(fā)酵液中的纖維素產量。
2.2 以糖蜜為原料添加瓊脂對細菌纖維素生產的影響
給出了纖維素產量隨時間的變化曲線。由圖 6 可知，在前 12 h 纖維素基本沒有合成，12 h 后開始緩慢合成，24 h 后合成速度加快，纖維素產量顯著提高，在 72 h 后纖維素的合成開始放緩，表明菌體已處于穩(wěn)定期至衰退期的過渡態(tài)，之后纖維素產量并未有明顯的增加。從單個曲線來看，加入 0.6%瓊脂的發(fā)酵液中纖維素產量在 48 h 后明顯高于其他組，最高產量達 6.5 g/L 左右，其次加入 0.4%與 0.8%瓊脂的發(fā)酵液中纖維素合成速度與終產量基本一致，沒有明顯的差異，而未加瓊脂發(fā)酵液中的纖維素產量從發(fā)酵初始至發(fā)酵終止一直落后于其他組，最終產量達 4.5 g/L 左右。可見瓊脂的加入能使最終發(fā)酵產量明顯提高，與木薯的結果一致。發(fā)酵最終的纖維素產量，從高到低依次為 0.6%＞0.4%＞0.8%＞0.2%＞0.0%，產量依次為 7.4、6.3、6.0、5.7 和 4.8 g/L。
2.3 木薯與糖蜜發(fā)酵結果的比較
從單個碳源的發(fā)酵結果來看，木薯發(fā)酵液中當加入 0.2%～0.6%的瓊脂時，無論從 BC 得率、產率還是菌濃等指標來看，發(fā)酵結果都是最優(yōu)的，加入瓊脂后的發(fā)酵液中菌體生長比添加前明顯加速，纖維素產量提高。糖蜜發(fā)酵液中當加入 0.4%～0.8%的瓊脂后，各項發(fā)酵指標均明顯提高，菌體濃度接近 2.0×106cells/mL，而未加瓊脂的發(fā)酵效果不理想，各項指標均低于其它各組。剪切力是動態(tài)發(fā)酵過程中的關鍵因素之一，增加發(fā)酵液粘度可以降低剪切力。Kouda 等在發(fā)酵液中添加了1%的 BC 懸浮物增加發(fā)酵液粘度后，BC 產量顯著增加。Bae 等在玉米漿―果糖培養(yǎng)基中添加瓊脂，結果顯示當加入 0.4%的瓊脂時 BC 產量最大，由未加入瓊脂的 8 g/L 提高到 12.8 g/L。
將兩種碳源進行對比可以發(fā)現(xiàn)，木薯的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于糖蜜，菌濃基本都在 2.0×106cells/mL 以上，而糖蜜發(fā)酵液的菌濃則基本處于 2.0×106cells/mL 之下。終點糖濃也清晰的反映了這一問題，木薯發(fā)酵終點糖濃基本處于 12～14 g/L 之間，而糖蜜發(fā)酵終點糖濃處于 14～20 g/L 之間，明顯高于前者，說明糖蜜發(fā)酵的還原糖轉化率不高，因此纖維素合成量低于前者。兩種原料發(fā)酵結果的顯著差異可能在于糖蜜作為一種工業(yè)廢料，其中摻雜了大量的色素以及其它抑制物，一定程度上抑制了菌體的生長。這需要在糖蜜預處理中進行針對性設計和優(yōu)化。
3 結論
在機械攪拌式發(fā)酵罐中，分別以相同還原糖濃度的木薯酶解液和糖蜜處理液作為發(fā)酵碳源，結果發(fā)現(xiàn)木薯水解液的發(fā)酵性能優(yōu)于糖蜜，BC 產量約高出 5%。為降低機械攪拌的剪切力，添加瓊脂可以改善木醋桿菌的生長，顯著提高細菌纖維素的產量。0.2%和 0.6% 分別是木薯水解液和糖蜜處理液的最佳瓊脂添加量，BC 產量可以分別達到 8.1 g/L 和 7.4 g/L。
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